Já adoecido, João Ramalho chamou o tabelião Lourenço Vaz, e ditou para ele seu testamento. O documento ficou transcrito nas notas do tabelião na vila de São Paulo.

Nele, estava narrada a vida de João Ramalho. Frei Gaspar da Madre de Deus alegou mais tarde que possuía uma cópia do documento original, mas poucas pessoas de fato tiveram acesso ou manusearam o testamento de Ramalho.

Algumas fontes dizem que Ramalho acabou tendo seu casamento católico com Isabel Dias, ou Bartira, depois disso; outras, porém, dizem que é provável que Nóbrega tenha descoberto que a primeira mulher de João Ramalho, a Catarina Fernandes das Vacas, ainda estava viva, pois no testamento que João Ramalho fez em 1580, Bartira, ou Isabel Dias, era figurada como sua criada, e não como sua mulher.